Revista de Investigación Talentos Volumen III. (2) Julio
- Diciembre 2016
ISSN Impreso: 1390-8197 ISSN Digital: 2631-2476
PROPAGACIÓN IN VITRO DEL SAUCE LLORÓN
(Salix Babilonica Lin.) A PARTIR
DE SEGMENTOS NODALES
IN VITRO PROPAGATION OF WEEPING WILLOW
(Salix Babilónica Lin.)
FROM NODAL SEGMENTS
Mario René López Vera
(1), Francisco Rodolfo Solórzano Murillo (1), Darwin Pomagualli (2), Tania María López Vera (1), Guilber
Enrique Vergara
Vélez (1)
(1)Laboratorio
de Microbiología área Agroindustrial, Escuela Superior Politécnica Agropecuaria
de Manabí
Manuel
Félix López, Calle 10 de agosto N°82 y Granda Centeno, Calceta, Manabí, Ecuador. Email: mrene782@gmail.com
(2)Departamento
de investigación, Universidad Estatal de Bolívar, Campus Laguacoto vía San Simón. CP 092.
Guaranda,
Bolívar, Ecuador. Email: dpomagualli@ueb.edu.ec
Resumen: El
objetivo de este estudio fue obtener un protocolo
de propagación in vitro del sauce llorón (S. babilónica) a
partir de segmentos nodales. El diseño experimental empleado para las tres fases fue el com- pletamente
aleatorizado, se realizó la prueba
de Tukey para la comparación de las
medias bajo los niveles de probabilidad de P≤0,05. Los tratamientos en la primera
fase fueron: tres dosis de hipoclorito de sodio (1,
2 y 3%) y una combinación con tres tiempos de desinfección (5, 10 y 15 minutos), sometidos a evaluación in vitro a los 21 días bajos
condiciones controladas
de laboratorio. Se evaluaron las variables: Número de ex-
plantes contaminados por hongos y bacterias. El 90% de los cultivos se presentaron
libres de gérmenes en el tratamiento
combinado con hipoclorito de sodio al 2% y 15 minutos. Los tratamientos de la
fase de mul- tiplicación in vitro
fueron: la combinación tres dosis de Bencilaminopurina (BAP),
ácido naptalenoacético (ANA), y acidogiberelico (AG3). Se evaluaron las variables: número y longitud
(mm) de brotes por explante.
Obteniéndose el mayor número y longitud de brotes por explante en el tratamiento de 0,045 mg/L-1 de BAP
+ 0,020 mg/L-1 de ANA + 0,050 mg/L-1 de AG3,
con 5,6 y 12,4 mm. Los tratamientos de la fase de enraiza-
miento in vitro fueron: tres
tipos de auxinas, de la cuales se seleccionó al ácido naptalenoacético (ANA), Acidoindolbutirico (AIB) y
Acidoindolacetico (AIA), en concentraciones estándar (1 mg/L-1). Se evaluaron
las variables: número y longitud de
raíces. Llegando a obtener un rendimiento
considerable de la eficacia con la fitohormona Acido indolacético (AIA) con un crecimiento promedio de cuatro raíces y una longitud promedio
de seis mm por vitroplanta.
Palabras claves: Salix
babilónica, establecimiento in vitro, multiplicación
in vitro,
reguladores
de creci-
miento, supervivencia.
Abstract: The aim in this study was to determinate a protocol
for in vitro propagation of the weeping
willow tree
(S. babilónica Lin), from nodal
segments. The experimental design was
completely randomized with three replicates and it was realized a Tukey test for the comparison in mediums using the
range of P≤ 0,05. In the establishment of explants under
in vitro conditions were evaluated three doses
of sodium hypochlorite (1, 2 and 3%) and three times with a combination of disinfection of explants (5, 10 and 15 minutes), evaluated
at 21 days under lab conditions, the variable to evaluate was number of
explants diseased, by bacteria and fungus, getting up to (90 %) of free cultures effects of contaminants in the combination of 2% and 15 minutes as the most effective
treatment. The next phase consist in replication in vitro and we evaluated three doses of
Bencilaminopurina (BAP), naptalenoacetic acid NAA and giberilic acid (GA3) and the number and growth
sprouts
per explant, getting the longest sprouts
(12,4mm) and numbers of nodal segments (5,6) in the con- centration of 0,045 (1 mg/L-1) BAP + 0,020 (1 mg/L-1) NAA + 0,050 (1 mg/L-1) GA3. We also evaluated
the efficiency of different
auxins (NAA), Indolacetic acid (IAA) and Indolbutiric acid (IBA) at standard concen- trations (1 mg/L-1) in the in vitro rooting phase.
Coming to obtain significant performance efficiency with phytohormone indole
acetic acid (AIA) with an average growth
of (4) roots and average length (1
mg /L-1) by vitroplant.
Keywords: Salix babilónica, in vitro
establishment, in vitro propagation, growth regulators,
Survival.
Recibido: 20 - 05 - 2016
Aceptado: 15 - 09 - 2016
Publicado como artículo científico en Revista de
Investigación Talentos III (2) 22-29
I. INTRODUCCIÓN
El
género Salix, sauces, junto con los
pópulos o ála- mos pertenecen a la familia
de las salicáceas. La dis- tribución de los sauces es muy
amplia, el género se originó en las zonas tropicales
del este de Asia, am- pliándose
más tarde
su distribución
hacia el norte hasta llegar a
las regiones frías de Europa y Nortea- mérica.
Por eso es posible encontrar especies de sau- ces
que se
adaptan a cualquier tipo de habitad.
Aunque el género está asociado
a suelos húmedos
de climas fríos y templados, existen varias especies de sauces que se han adaptado
a sitios secos, incluyendo zonas alpinas y de altas
latitudes árticas (Adema et al., 2008).
Smart et al., (2005), Los sauces juegan un papel im-
portante en el desarrollo de paisajes y en el manteni-
miento del balance ecológico de
los ecosistemas.
Existen diversos proyectos de mejoramiento de sau- ces ya que pueden ser
utilizados como material para obtener bioenergía,
principios activos, biorremedia- ción y estabilización de sitios. Su tasa de
transpira- ción es relativamente
alta y su resistencia a
inundaciones estacionales, con sus raíces que se ex- tienden a varios metros
por el terreno, son ventajas particularmente
en tierras húmedas,
donde el control de la escorrentía freática es
esencial para reducir la contaminación.
La mayoría
de los sauces pueden ser propagados fá- cilmente, existen algunas especies o
clones con difi- cultades para enraizar. Para
superar este inconveniente, el uso de nuevas
técnicas de propaga- ción permite
la multiplicación de individuos o clones selectos.
Una vez
localizados los ejemplares selec- cionados por sus características deseables, es posible reproducirlos en todo sus rasgos,
obteniendo clones a partir de dos técnicas
básicas: la producción de es- tacas o micropropagación
y el cultivo de tejidos in vitro
o micropropagación.
El cultivo
de tejidos
es una
herramienta que sirve para propagar
diferentes especies vegetales incluido al sauce, y además esta técnica basa su accionar
en el uso de un medio de cultivo especifico suplemen- tado con
componentes tales como: sales minerales,
vitaminas y reguladores de crecimiento apropiados
para hacer que una célula totipotente pueda diferen- ciarse para obtener una planta completa
libre de gér-
menes (Chung y Carrasco, 2008). Los estudios de la multiplicación encontrado
sobre el sauce llorón S. ba- bilónica están dirigidos casi exclusivamente a la mul- tiplicación de forma asexual por
método de esqueje, algo que limita su aplicación al proceso de multipli- cación masiva y de conservación (Rivera y Galliusi,
2006). En este trabajo
se presenta la obtención de los
protocolos de establecimiento, multiplicación y en- raizamiento in vitro
del sauce llorón S. babilónica a
partir de segmentos nodales.
II. MATERIALES Y METODOS
A. Ubicación geográfica donde se efectuó
la investi- gación
La investigación se realizó en el Laboratorio de Bio- tecnología Vegetal,
Carrera de Agrícola de la Escuela
Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí Ma-
nuel Félix López (ESPAM MFL),
ubicada en la ca- becera cantonal del
cantón Bolívar, de la
provincia de Manabí, Ecuador. Situada geográficamente entre las coordenadas 00o 50’ 39” Latitud
Sur, 80o 09’ 33”
Longitud Oeste y una Altitud
de 15,5940 msnm.
Las características climáticas de la zona son: Temperatura media anual de 25,6
°C, Precipitación
medio anual de 838,7 mm, Humedad relativa media de 78%,
T. heliofanía de 1.158 horas sola °C
al año y Evapora- ción de 1.365,2 cm (Vera,
2006).
B. Material vegetal
La recolección de S. babilónica, se realizó de plantas
adultas de 20 años de edad. El explante obtenido
fue a partir de varetas de 15 cm de longitud y 8 mm de diámetro, fueron
colectados y transportados en caja térmica de aclimatación, se rotularon con
cintas ad- hesiva, registrada con un código que
se incluyó
en los detalles de la siembra. Las varetas fueron sumer- gidas
diez minutos en una solución
antiséptica de be- nomyl
en dosis
de 2,5
g/L, al que se le
añadió tres gotas de tween
20 por cada 100 mL solución y a con- tinuación se le realizó enjuagues
con agua destilada por dos veces. En vivero se sumergió las varetas en una solución de (AIA) durante 10 minutos, y
final- mente se procedió a sembrarlas en un sustrato com- puesto por
tierra, arena y materia orgánica, se
dejó enterrado una yema de la vareta
y dos expuestas al ambiente con riego abundante en la mañana y en la tarde durante
30 días, su manejo preventivo de enfer- medades, se lo realizó
con el mismo fungicida cada
72 horas y con la misma
dosis.
C. Establecimiento aséptico del cultivo
Los explantes
de S. babilónica, fueron sumergidos en
los siguientes
tratamientos: tres concentraciones de hipoclorito de sodio al 5, 10 y 15 % de cloro activo
al que se le añadió tres gotas de Tween 20 por cada
100 mL de solución
combinadas con tres tiempos de exposición
de 5,
10 y 15
minutos. En la cabina de
flujo laminar se volvió a enjuagar
con suficiente agua
destilada estéril por dos veces.
Antes de obtener el
explante todos los materiales disección fueron pasa- dos por alcohol al 97% y
rápidamente fueron flame- ados. Inmediatamente los explantes se transfirieron
a los medios de establecimiento in vitro de S. babiló-
nica, el medio estuvo conformado por las sales y vi- taminas M&S
(Murashige & Skoog, 1962),
suplementado con el 3% (p/v) de sacarosa, gelificado
con 0,6% (p/v) de Phytagel. Se determinaron las si- guientes variables: número
explantes contaminados por hongos y bacterias.
D. Multiplicación in vitro
Luego del periodo
de adaptación en condiciones con-
troladas por 21 días, los explantes sanos fueron trans-
feridos a los siguientes
tratamientos: BAP
0,022 mg/L-1 + ANA 0,010 mg/L-1 + AG3 0,025 mg/L-1, BAP 0,045 mg/L-1 + ANA 0,020 mg/L-1 + AG3 0,050
mg/ L-1 y BAP 0,068 mg/L-1 + ANA 0,030 mg/L-1 + AG3 0,075
mg/L-1, el medio de cultivo M&S estuvo
conformado por el 100% de la concentración de sus sales y vitaminas, suplementado con 3% (p/v)
de sa- carosa,
gelificado con 0,6% (p/v) de Phytagel. Se mi-
dieron las siguientes variables: número
de brotes por explante y longitud de los brotes
(mm).
E. Enraizamiento in vitro
Los
brotes fueron transferidos a los siguientes trata- mientos: 1,0 mg/L-1 de ANA, AIB y AIA, el medio de cultivo M&S se redujo su
concentración al 50% de las sales
y vitaminas, suplementado con 3% (p/v) de sacarosa, gelificado con 0,6%
(p/v) de Phytagel, los medios en
las tres
fases fueron distribuidos en frasco de vidrio pequeño (6,5 cm de
altura x 5,5 cm de diámetro) con
20 mL.
Los cultivos
en las
tres fases, se incubaron a temperatura de 25±2 °C, la cual estuvo
conformada con luz artificial de
lámparas fluorescentes reguladas automáticamente en 16/8 horas de foto periodo
y escotoperiodo, con una inten- sidad
luminosa de aproximadamente 252-500 lux
(3,15-6,25 µmol.m2 .s). Se utilizó un diseño
experimental
al azar (DCA) unifactorial con 9 répli- cas por cada tratamiento; cada unidad
experimental fue de 3 frascos, se determinaron las siguientes va- riables:
número y longitud de raíces (cm). Los datos de
las variables
en las
tres fases, se analizaron me- diante un análisis de varianza y separación de medias
a través de la prueba
de Tukey (P≤0,05), para las me- dias con valores cero se transformaron según x1=
√(x+0,5), se usó del paquete estadístico InfoStat ver- sión 2008 Di Rienzo, et al. (2008), y la graficación de los
resultados el Microsoft Excel (López, 2005).
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A. Establecimiento in vitro
En la Tabla I, se observa el número de explantes con- taminados por hongos a los 21 días
ver Fig. 1, des- pués de inoculado el explantes en M&S, alcanzando su mayor
número de explantes contaminados por hongos el T1, T5 y T9 con 1,09; 0,87 y 1,04; igual- mente, se puede apreciar, que los tratamientos en los cuales se obtuvo éxito en el control de la contamina- ción por hongos fueron el
T3, T4 y T6 con 0,70 ex- plantes
contaminados, que equivale a cero contaminación.
En la Tabla 1, se observa el número de explantes con-
taminados por bacterias a los 21 días Fig. 1, después
de inoculado el explantes al medio de cultivo M&S, alcanzando su mayor
número de explantes contami- nados por bacterias el T1 y T5 con 1,16 y 1,04; igual-
mente, se puede apreciar, que los tratamientos en los
cuales se obtuvo éxito en el control
de la contamina- ción por hongos
fueron el T6, T7 y T8 con 0,70; 0,99 y 0,87
explantes contaminados por bacterias que
equivale a cero contaminación.
El T6 resultó
ser el mejor con cero número de explan-
tes contaminados en ambas variables analizadas ver Fig. 1. Estos resultados permiten establecer que el hi-
poclorito de sodio es funcional en la desinfección de los segmentos nodales de S.
babilónica, lo que per- mitió el establecimiento
in
vitro
de la especie, que concuerdan totalmente en cuanto a la
concentración de hipoclorito de sodio a los obtenidos por Garay et al., (2005), quienes en su investigación de micropro- pagación in vitro
de clones de sauce, indican que el T6 resultó eficiente en la desinfección de los segmen-
tos
nodales de sauce, sin embargo, el
tiempo de des- infección utilizado por
estos autores fue superior comparado con el tiempo empleado en esta investi-
gación; estableciendo una diferencia de 15 minutos más de exposición.
A B
Fig. 1. Explantes de S. babilónica: a los 21 días de haber iniciado
el cultivo (A) tratamiento infectado por Hongos y, (B) tratamiento
infectado por bacterias, visto desde abajo.
B. Multiplicación in vitro
En la Tabla II, se observa el número de brotes por explante de S. babilónica a los 30 días, después de trans- ferido el explantes al medio de cultivo M&S
suplementado con los reguladores de crecimientos, alcanzando su mayor número y longitud de
brotes explantes en el T2 con 5,6.
TABLA II.
NÚMERO Y LONGITUD DE BROTES OBTENIDOS EN LA FASE
DE MULTIPLICACIÓN IN VITRO DE (S. babilónica L.)
CV%= Coeficientes de variación,
Promedios con letras iguales en una
misma fila no difieren
estadísticamente, según Tukey
(P≤0,05).
Estos resultados nos permiten establecer que las con-
centraciones bajas de las fitohormonas
utilizadas: BAP, ANA y AG3 son eficientes en la fase de multi-
plicación in vitro de esta especie ya que promovieron
mayor
número de brote y longitud por explante ver Fig. 2, resultados se asemejan con
los obtenidos por Betancourt (2002), en su investigación de propaga-
ción in vitro de
Lulo la Selva
(Solanum quitoense L.)
Detallando que el mejor medio
de cultivo para la re- generación meristemática es suplementado con BAP
0.040 mg/L-1, ANA 0,022 mg/L-1, AG3 0,050 mg/L-
1conocido como medio yuca y desarrollado por (Roca
et al., 1991).
A B
Fig. 2. Explantes de S.
babilónica en la fase de multiplicación: (A) Explantes en incubación controlada y,
(B) Longitud de brote.
C. Enraizamiento in vitro
En la Tabla III, se observa
el número y longitud de raíces por vitroplanta de S. babilónica a los 30 días ver Fig. 3, después de transferido
el explantes al
medio
de cultivo M&S al 50% de su concentración de sus sales y suplementado con
los reguladores de crecimientos, alcanzando su mayor número y longi- tud de raíces por vitroplanta en el T3 con 2,19 y 2,41.
De acuerdo con los resultados obtenidos, el T3 con 1 mg/L-1 de AIA, resultó ser el mejor, estos resultados
nos permiten establecer, que la concentración de
la fitohormona AIA, es eficiente en la fase de enraiza- miento in vitro de esta
especie, ya que promovieron mayor número y longitud de raíces. Estos resultados
concuerdan a los obtenidos por Álvarez et al. (2011),
quien sostiene
en su investigación, que los regulado-
res de
crecimiento vegetal en la organogénesis
de Gmelina arbórea, usando 1,0 mg/L-1 de AIA, existe una
relación directa entre
la concentración de auxina
y el desarrollo
de la
raíz; destacando que a mayor dosis, la longitud y el número de raíces se incremen- tan.
A B
Fig. 3. Explantes de S. babilónica en la fase de Enraizamiento: (A) Número de raíces por vitroplanta y, (B) Longitud de raíces por vitroplanta.
V. CONCLUSIONES
En la fase establecimiento in vitro, el 90% de los cul- tivos
se presentaron
libres de gérmenes en el
trata- miento combinado con hipoclorito de sodio al 2% y
15
minutos. En la fase se multiplicación in
vitro, se obtuvo el mayor número y longitud
de brotes por ex-
plante en el tratamiento de 0,045 mg/L-1 de BAP +
0,020 mg/L-1 de ANA + 0,050 mg/L-1 de AG3, con
5,6 y 12,4 mm. En la fase de enraizamiento in vitro
se alcanzó
un rendimiento considerable de la eficacia
con la fitohormona ácido indolacético (AIA) con un crecimiento promedio
de cuatro raíces y una longitud promedio de seis mm por
vitroplanta.
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