BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PRESENTES EN EL MUCÍLAGO DE CACAO (Theobroma cacao L.)DE DOS VARIEDADES
LACTIC ACID BACTERIA PRESENT IN THE MUCILAGE OF COCOA (Theobroma cacao L.) OF TWO VARIETIES
Christian Amable
Vallejo Torres(1-2), Jaime Fabián Vera Chang(2), Jorge
Gustavo Quintana Zamora(2), Diana Carolina Verdezoto Quinatoa(2),
Lisseth Estefanía Cajas Anchundia(2), Thalía Yanina Mendoza Garcìa(2)
(1)Carrera de Ingeniería Agroindustrial. Facultad de
Ciencias de la Ingeniería. Universidad Tecnológica Equinoccial (UTE) Campus
Arturo Ruiz Mora, Km. 4 1/2 vía a Chone, Santo Domingo de los
Tsáchilas – Ecuador.
(2)Carrera de Ingeniería en Alimentos, Facultad de
Ciencias Pecuarias de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo-(UTEQ), Ubicada
en el km 7 ½ vía Quevedo–El Empalme, entrada a Mocache Quevedo, Los Ríos,
Ecuador
Resumen: La producción y distribución de
las bacterias acido lácticas (BAL), se generan gracias a la elaboración de
alimentos fermentados, utilizándolas por su habilidad de acidificación y
preservación en los mismos, por ello, este trabajo se orientó en identificar y caracterizar
bacterias ácido lácticas (Lactococcus spp) del mucílago de dos variedades de
cacao, Nacional EET-103 y Trinitario CCN-51, para usarlas como precursores de
conservación natural en productos alimenticios mínimamente procesados y
frescos. Se aplicó un diseño completamente al azar (DCA) con un arreglo
bi-factorial AxB, con 16 tratamientos y 4 repeticiones. Para la determinación
de la diferencia significativa de los tratamientos se utilizó la prueba de
Tukey, al 5 % de probabilidad. Con base al análisis estadístico se determinó
que las bacterias Lactococcus Spp, aisladas del mucílago de cacao Nacional
(EET-103) y Trinitario (CCN-51) no presentaron susceptibilidad ante los
antibióticos como oxitetraciclina, penicilina y enrofloxacina, solo las BAL
extraída del cacao Trinitario, presentaron susceptibilidad al antibiótico
enrofloxacina. El género de bacteria Lactococcus Spp, aislada en las dos
variedades, mostró sensibilidad al producto de limpieza y desinfección a base
de alcohol isopropílico (C3H8O)
y sulfato de cobre (CuSO4), y presentó
resistencia a los productos de limpieza y desinfección Yodo Total-12 e
hidróxido de sodio (NaOH). Las bacterias Lactococcus spp extraídas del cacao
Nacional (EET-103), presentaron mayor capacidad de acidificación frente a los
antibióticos en comparación a las bacterias extraídas del cacao Trinitario.
Mientras que las bacterias extraídas de ambas variedades de cacao se comportaron
igual en la capacidad de acidificación de la leche frente a diversos productos
de limpieza y desinfección.
Palabras
claves: antibióticos, desinfectantes, Lactococcus Spp, mucílago, fermentación.
Abstract: The production and distribution of lactic acid bacteria (LAB), are
generated by the production of fermented foods, using them for their ability to
acidify and preserve them, therefore, this work was aimed at identifying and
characterizing lactic acid bacteria ( Lactococcus spp) of the mucilage of two
varieties of cocoa, National EET-103 and Trinitario CCN-51, to be used as
natural conservation precursors in minimally processed and fresh food products.
A completely randomized design (DCA) was applied with a bi-factorial
arrangement AxB, with 16 treatments and 4 repetitions. For the determination of
the significant difference of the treatments the Tukey test was used, at 5%
probability. Based on the statistical analysis, it was determined that the
Lactococcus Spp bacteria isolated from the cocoa mucilage National (EET-103)
and Trinitario (CCN-51) did not present susceptibility to antibiotics such as
oxytetracycline, penicillin and enrofloxacin, only the BAL extracted from cocoa
Trinitario, presented susceptibility to the antibiotic enrofloxacin. The genus
of bacteria Lactococcus Spp, isolated in the two varieties, showed sensitivity
to the cleaning and disinfection product based on isopropyl alcohol (C3H8O)
and copper sulfate (CuSO4), and showed resistance to the products of cleaning and disinfection
Total Iodine-12 and sodium hydroxide (NaOH). The bacteria Lactococcus spp.
Extracted from the National cocoa (EET-103), presented greater capacity of
acidification in front of the antibiotics in comparison to the bacteria
extracted from the Trinitario cacao. While the bacteria extracted from both
varieties of cocoa behaved equally in the capacity of acidification of milk
against various cleaning and disinfection products.
Key words: antibiotics,
disinfectants, Lactococcus Spp, mucilage, fermentation.
Recibido: 4 de
enero de 2018
Aceptado: 1 de
junio de 2018
Publicado como artículo científico en Revista de Investigación Talentos V(1) 59-68
I.
INTRODUCCIÓN
Los procesos agrícolas e industriales
del T. cacao generan una serie de
subproductos que tienen poca o ninguna utilización y que a nivel de finca, son
desechados, uno de estos es el mucilago de cacao, habitualmente se desaprovecha
más de 70 litros por tonelada de este material (Vallejo et al., 2016).
Las bacterias ácido lácticas se componen por un grupo
de bacterias Gram positivas, habitualmente inmóviles, no esporuladas, con forma
de cocos o bacilos. Son microorganismos fermentadores de carbohidratos con
producción de ácido acético como producto principal
Actualmente,
las bacterias ácido lácticas (BAL), son conocidas por su principal
participación en la elaboración de quesos, ya que estas además de brindar
beneficios a la salud del consumidor, ofrecen características de sabor acidulado;
asimismo, las bacterias lácticas son empleadas por las industrias alimenticias
en la elaboración del yogurt, vino, encurtir carnes, embutidos y pescados (Córdoba y Malo, 2008).
Dentro de la clasificación de los quesos, se encuentran el queso crema de
textura suave coagulada, no granulada y cremosa, de sabor ácido debido a la
presencia de bacterias ácido lácticas Gram positivas como las del género Lactococcus y Leuconostoc, las cuales producen ácido láctico, y además brindan
un olor característico al producto. Este derivado lácteo es muy popular en
América del Norte, usualmente utilizado para untar en panecillos, aderezo para
ensaladas, también es empleado como un ingrediente para la elaboración de
postres y tartas (Phadungath, 2005).
En Ecuador la cantidad de empresas dedicadas a la elaboración de queso
crema, es mínima, comparada a las que ofrecen queso fresco, ya que en el país
ocho de cada diez ecuatorianos dicen preferir queso fresco; le sigue en
preferencia el mozarela, queso crema, maduro, semi maduro. Sin embargo, la
marca más reconocida de queso crema en el país es la industria Láctea Toni S.A.
(Gallardo, 2012).
En
base a lo anterior el propósito de la investigación es identificar y caracterizar bacterias ácido lácticas
(Lactococcus spp) del mucílago de dos
variedades de cacao, Nacional EET-103 y Trinitario CCN-51, para usarlas como
precursores de conservación natural en productos alimenticios mínimamente
procesados y frescos.
II.
MATERIALES Y MÉTODOS
La presente investigación se llevó
a cabo en el Laboratorio de Rumiología y Bromatología de la Facultad de
Ciencias Pecuarias de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo, la misma que
está ubicada en el Km 7 ½ de la vía Quevedo – El Empalme, entrada al cantón
Mocache, Provincia de Los Ríos.
La fruta se recolectó
en la Finca Experimental “La Represa” propiedad de la Universidad Técnica
Estatal de Quevedo (UTEQ), provincia de Los Ríos, Quevedo - Ecuador. La
recolección de la fruta madura se la realizó en la mañana, 24 horas antes del
procesamiento, de forma manual con tijeras de podar marca Felco 3, se
lavaron en el laboratorio las frutas con
agua clorada (100 ppm cloro) y se enjuagaron con agua potable. Se trocearon los
frutos realizando 2 cortes longitudinales y 2 transversales y se separó
manualmente la cáscara de las almendras. Para la extracción del exudado, se
utilizó un lienzo de tela tipo quesero 100% algodón y con un entramado especial
de 100 a 200µm que facilita el paso del líquido. Tiene una medida de 75x75 cm
que sirvió para filtrar 2 litros de mucílago mediante presión.
Del mucílago , luego de las 24, 48 y 72 horas en fermentación, se tomó una muestra de 10 ml y se realizaron
diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-6, se sembró por
duplicado en cajas de petri conteniendo medios selectivos para bacterias ácido
láctico: agar MRS de Man, Rogosa y Sharpe .Las placas se incubarán en
condiciones de microaerofilia durante 48 horas a 37 °C, las colonias
seleccionadas fueron purificadas tres veces para obtener un cultivo puro, luego
fueron reproducidas en el mismo medio de cultivo y conservadas en refrigeración
para ensayos posteriores.
Las cepas purificadas se las identificó de acuerdo
con criterios de su morfología mediante tinción de Gram. Las pruebas de
identificación fueron hechas principalmente para bacterias ácido lácticas (Lactococcus
spp) de las cuales solo se caracterizó estos microorganismos porque son los
que más se utilizan como fuente de cepas iniciadoras en la industria
alimentaria.
Los discos fueron realizados con papel filtro se
esterilizaron dentro del autoclave, a una temperatura de 120°C a 350 kPa
durante 20 minuto, y luego se secaron dentro de la cabina de seguridad
previamente con luz UV.
Una vez secos, se colocaron en orden en cajas petri
esterilizadas en las cuales
se les vertió el antibiótico, producto de limpieza y desinfección, respectivamente
(sin antibiótico 0µg/ml, antibiótico oxitetraciclina 30 µg/ml antibiótico
penicilina 10 µg/ml, antibiótico enrofloxacina 5 µg/ml, sin producto de
limpieza y desinfección 0 µg/ml, producto de limpieza y desinfección Yodo
Total-12 100 mg/L, producto de limpieza y desinfección base de alcohol
isopropílico y sulfato de cobre 100 mg/l y producto de limpieza y desinfección NAOH
50 mg/L).
Cada cepa en estudio, se suspendió 20 UFC en agua de
peptona estéril en tubos de ensayos ajustándose a una concentración de 0.5
McFarland. Con
una micropipeta se tomó 500 cc del inóculo del tubo de ensayo y se sembró en la
caja petri esparciéndolo con un asa de cayado para siembra. Se inoculó la superficie del agar, rotando la
caja petri 60 º cada vez para asegurar una completa distribución del inóculo,
de esta forma se obtienen zonas de inhibición uniformemente circulares.
Los discos con la carga de antibióticos y productos
de limpieza fueron aplicados dentro de la fase de inoculación. Donde se utilizó
tres discos por caja petri en posición triangular. Se tomaron con pinzas
estériles y una vez ubicados sobre el medio de cultivo se ejerció una ligera
presión con la finalidad de evitar que se muevan o se desprendan. Las cajas
inoculadas y con los discos ya aplicados se incubaron invertidas a 37 ºC por el
término de 48 horas. Después de dicho tiempo, cada caja petri fue examinada
visualmente y se midió el diámetro de las zonas de inhibición, incluyendo el disco.
Para esta medición se tomó 150 ml de leche descremada UHT “Mi Ranchito”, donde
se diluyó 20 UFC de BAL (Lactococcus
spp) en 1 ml de agua destilada estéril, esta disolución se le agregó a la
leche y por último se adicionó los antibióticos, productos de limpieza y
desinfección respectivamente, se incubaron 37 ºC y se midió el descenso del pH hasta
8 horas.
Para elaborar los cultivos iniciadores, a ser
empleados en la fabricación de queso crema, se tomaron 20 cepas del género
Lactococcus spp y con la ayuda de un
agitador bórtex se disolvieron en tubos de ensayo con 5 ml de leche, luego se
agregó a la leche con la que se elaboró el queso crema.
Se tomaron 2000 ml de leche
entera pasteurizada a temperatura ambiente por cada tratamiento, se agregó la
solución de 5 ml, se mezcló y se colocaron tarrinas estériles de 500ml, se taparon y
colocaron en baño maría a diferentes temperaturas de 35, 40 y 45 °C y otras se
dejaron al ambiente aproximadamente a 30 °C, por 24 horas. Una
vez realizada la incubación con bacterias a diferentes temperaturas, se realizó
el desuerado para obtener el queso crema, tomando los pesos en una balanza
gramera, antes y después de la pérdida del suero, después se agregó 1,5 % de
sal refinada sobre el peso del queso crema que resultó del proceso, finalmente
se procedió a almacenar a una temperatura de 8 °C.
Al producto final se le
realizó una valoración bromatológica como: pH,
grasa, humedad, cenizas y proteína, esto de acuerdo a los métodos de ensayos
establecidos en la norma INEN 1528. Para la determinación de la carga
bacteriana en el producto terminado, se utilizó agar MacConky, que permitió
conocer si existía la presencia de las bacterias E. Coli y Salmonella, bajo
los métodos de ensayos estipulados en la norma NTE INEN 1 529 – 7.
Para la determinación de las
características organolépticas (color, aroma, sabor), se realizó la evaluación
sensorial mediante la Prueba de Kruskal Wallis afectiva de características no
estructurales, Los resultados de los ensayos para la caracterización de las BAL
y los análisis bromatológicos, pH bajo el método NTE INEN-ISO 10523, grasa por
extracción con el método NTE INEN-ISO 2446:2013, humedad y ceniza conforme lo
dispone la norma NTE INEN 14:1984, proteína total mediante destilación con el
método establecidos en la norma técnica NTE INEN-ISO 8968-1IDF 20-1, del queso
crema, fueron analizados mediante una ANDEVA y comparados mediante Tukey
(p<0.05); los resultados obtenidos se tabularon en un programa estadístico de software libre Infostat versión 2011 (Di Rienzo,
2011).
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el medio MRS se identificó
el género Lactococcus spp del mucílago
del cacao tipo Nacional EET-103 en los diferentes tiempos de fermentación como
se representa en las Figuras 1, 2 y 3.
Fig. 1. Aislamiento e identificación de bacterias acido lácticas presentes en el
mucílago de cacao (Theobroma cacao L) tipo Nacional EET-103.
